【背景】

类罂粟碱(一种苄基异喹啉生物碱 BIA)药用价值宝贵,所有鸦片制剂(如吗啡、可待因)和半合成品类罂粟碱(如氢可酮、氢吗啡酮)的来源仅限于罂粟种植,产量易受植物生长周期特性、气候、虫害、环境等多方面影响。化学合成此类复杂分子目前还未能实现规模化生产,不具有商业竞争价值。而基于改造酵母菌成功合成青蒿素并顺利上市的成功先例,利用微生物生产类罂粟碱切实可行,有利于解决源自种植罂粟供应的多种难题。

【方法】

  1. 构建酵母菌株,制造S-网脉碱;
  2. 为了转移更多的C流量用于制造BIA中间体S-网脉碱,在CEN.PK2酵母菌株中整合了五个新设计的含有编码17种源自不同植物、动物、异种酵母的生物酶的基因模块(I、II、III、IV、V)。

  3. 设计代谢通路模块,实现S-网脉碱转化为二甲基吗啡;
  4. 将经过密码子优化的DRS-DRR序列插入酵母基因组中,实现差向异构体催化作用,使S-网脉碱变为R-网脉碱。设计通路模块VI,导入多种酶变体表达基因序列,将R-网脉碱转化成二甲基吗啡。

  5. 延伸生物合成通路,实现二甲基吗啡转化为氢可酮。
  6. 进一步延长已构建的代谢通路,引入能够编码脱甲基酶T60DM和还原酶morB的氢可酮合成通路VII(图1)。

代谢通路

【结果】

  1. 整合了模块I-V的酵母菌株(CSY1060, CSY1061)比只整合了模块I-IV的菌株(CSY1058)的S-网脉碱产量高4倍(图2)。
  2. 整合不同模块的酵母菌株生成网脉碱情况图

  3. 集合了代谢通路模块VI的酵母菌株,最终能够生成6.4 μg/L的二甲基吗啡;集合了代谢通路模块VII的酵母菌株,最终能够生产少量的氢可酮(0.3 μg/L)(图3) 。
  4. 生物合成产物和标准品检测方法的对比图

参考文献
Stephanie, G., et al., Complete biosesynthesis of opioids in yeast.2015. 349(6252): p.1095-1100.