用于哺乳动物细胞CRISPR-Cas9的基因编辑

【背景】

靶向核酸酶以其高效性成为了介导基因组编辑的强大工具。目前,世界上应用最广泛的基因编辑工具是从细菌的免疫系统中分离出来的CRISPR-Cas9系统。它是通过sgRNA介导Cas9核酸内切酶对基因组特定序列进行剪切,并通过非同源末端修复(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来实现基因的敲除和敲入(knock-out/in),从而对哺乳动物细胞内或改造细胞株的下游功能进行研究。为了最大程度的降低脱靶效率,采取了双切口策略,使用成对的sgRNA介导Cas9核酸内切酶。CRIPSR-Cas9 技术周期短,从靶点设计开始,可以在短至1-2周内实现基因修饰,并且可以在2-3周内得到修饰过的克隆细胞系。CRISPR-Cas9技术可对哺乳动物基因的进行高效精确的敲除或敲入,可广泛应用于基因功能的后续验证工作中。

【方法】

  1. sgRNA的设计方案
  2. 推荐使用CRISPR设计工具(http://tools.genome-engineering.org)来进行靶位点的选择(图1);
    sgRNA靶位点的确定

  3. 构建sgRNA和Cas9表达载体
  4. 根据设计方案构建sgRNA和Cas9载体,同时在Cas9载体中添加GFP或嘌呤霉素抗性基因以帮助后续筛选转染细胞。分别构建了CRISPR-Cas9的单载体系统和双载体系统(图2);
    sgRNA表达载体的构建

  5. 构建修复模版
  6. 为了实现基因的敲入,需要构建同源模板。同源模板由需要敲入的基因和靶位点两侧序列组成的两同源臂构成。通常情况下,修复模板为载体形式时,单侧的同源臂长度要超过500bp;为单链DNA的形式时,单侧的同源臂长度至少要40bp(图3);
    质粒和ssODN作为模板进行knock-in

  7. 功能验证
  8. 功能验证的方法包括Surveyor错配内切酶检测法、HindIII酶切位点法及测序方法(图4)。Surveyor错配酶可以对异源双链进行切割,并通过凝胶条带的强度来确定切割DNA的分数,从而计算Cas9的切割效率(Indel百分比)(图2);在插入的目标基因中插入了HindIII酶切位点可对PCR产物进行切割,同样通过凝胶条带的强度来计算Cas9的切割效率(图3)。
    Surveyor错配内切酶验证knock-out

 
【结论】

  1. 设计两个sgRNA同时对人类HEK293FT细胞中的DYRK1A和GRIN2B基因进行敲除,每个位点敲除效率为65~68%(图5),证明了CRISPR-Cas9能够简便且高效的应用于哺乳动物基因组;
  2. DYRK1A和GRIN2B knock-out效率

  3. 成对的sgRNA对EMX1基因外显子进行敲除,可对基因造成微小精确的编辑效果(图6);
  4. EMX1基因外显子敲除效率

  5. 基因敲入时设计的修复模板既可以是质粒也可以是单链的DNA(ssODN),基因敲入效率最低为0.18%,最高为27%。基因敲入的效率远低于基因敲除的效率(图7)。
  6. 使用质粒和ssOND修复的基因敲入效率

 

参考文献
Ran F A, Hsu P D, Wright J, et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system[J]. Nature protocols, 2013, 8(11): 2281-2308.