以CRISPR-Cas9为基础的合成AND门基因环路用于识别膀胱癌细胞

【背景】

随着合成生物学的发展,对各个生物元件解析也更加透彻,基因自调控环路重新出现在人们视野中,基因自调控是通过合成生物学方法对生物元件重新设计构建一个环路,该环路上含有对生物上游元件的他调控,对下游基因产生与计算机领域的或、与、非逻辑门类似的逻辑关系的反馈。

深圳第二人民医院蔡志明教授实验室通过基因环路与最新基因编辑技术——CRISPR-Cas9,对膀胱癌细胞进行研究,为治疗膀胱癌提供了新的方法。目前,对于癌症治疗的策略主要是化学及放射性方法,不具有针对性和高效性,对于正常细胞也有较大的损伤。而蔡教授团队设计的一种基于CRISPR-Cas9系统的AND逻辑门基因环路系统能够解决针对性及高效性这一难题。

【方法】

  1. 该基因环路需要两个启动子,当且仅当两个启动子同时作用时,目的基因才能进行表达(图1)。
  2. 双启动子基因环路设计

  3. 选用hUPII启动子控制Cas9、hTERT控制sgRNA-Lac序列,而这两种启动子只在膀胱癌细胞中启动(下文有实验证明)当两种启动子同时启动时,释放sgRNA-Lac,与SV40启动的LacI基因靶向,从而使Cas9基因编辑Lac I基因,使其失去活性,不与CMV启动的报告基因前的lacO结合,使报告基因表达。所选用的报告基因有荧光素酶,hBAX,p21和E-cadherin4种,设计了4种环路(图2)。
  4. 四种报告基因环路设计方案

  5. 作者选择了4种不同类型的膀胱癌细胞(T24/5637/SW-780/J82),一种无限增殖细胞(293T),三种其他癌细胞(HeLa,A549和PC-3),以及一个从皮肤组织中来的正常原生母纤维细胞进行试验。在SC-1试验中,选用的报告基因是人肾荧光毒素,在以上细胞内预先导入PGL3-TK-Fluc载体。然后分别在每种细胞中导入设计的SC-1环路,同时,相对独立地在每种细胞中加入PCDNA3.1-hTERT-Rluc作为对照组。
  6. 选用hBAX、p21和E-cadherin作为SC-2、SC-3、SC-4环路的报告基因。分别调控细胞凋亡、抑制细胞生长和迁移,与SC-1一致,同样能够特异表达。

【结论】

  1. 几种转染合成环路1(SC-1)或hTERT-Rluc载体细胞系的荧光毒素水平的表达验证了所用的细胞系事先转染pGL3-TK-Fluc载体(图3),Rluc与Fluc之间的比值作为生物荧光毒素的表达活性,每种细胞都做了3~5个独立试验,其结果由柱形表示。在设计的SC-1中,只有在T24、5637、SW-780、J82这4种膀胱癌细胞系检测到荧光活性,而在其它细胞中没有检到,单启动子对照也没有活性,这说明该环路设计能够特定的靶向膀胱癌细胞而对其他细胞不起作用。
  2. 细胞系的荧光毒素的表达水平

  3. 在SC-2、SC-3、SC-4试验中,通过ELISA方法探测死亡细胞来计算,空白对照所用pCDNA3空质粒,每个实验同样独立3~5次。T24、5637、SW-780、J82这4种膀胱癌细胞系凋亡明显(图4)。
  4. 不同细胞系其细胞凋亡水平

  5. 转染SC-3或者pCDNA3-hTERT-21的细胞系生长情况。用CCK-8的方案在不同时间点测量各细胞系的增殖情况,细胞增殖曲线通过方差分析得到,SC-3抑制了T24,5637,SW-780及J82细胞系的增殖,而SC-1促进了上述细胞系的增殖(图5) 。
  6. SC-3

  7. 转染了SC-4或者SC-1或者hTERT-E-cadherin载体细胞系的细胞迁移情况(图6),在SC-4环路下,T24,5637,SW-780及J82细胞系的细胞迁移明显被抑制。
  8. 3种载体的细胞系中细胞迁移情况

综上所述,蔡教授团队成功地在哺乳动物细胞中设计了一组基因环路,为定向治疗癌细胞提供了高效且具有针对性的方案。

参考文献
Liu, Y., et al., Synthesizing AND gate genetic circuits based on CRISPR-Cas9 for identification of bladder cancer cells. Nat Commun, 2014. 5: p. 5393.